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本制品是一种采用SYBR Green I嵌合荧光法进行Real-Time PCR的2×浓度的预混型试剂。本制品中含有Real-Time PCR反应需要的合适浓度的SYBR Green I，热启动Taq DNA聚合酶，适合Real-Time PCR的Buffer组合，可以有效抑制非特异性的PCR扩增，大大提高PCR的扩增效率，适合进行高灵敏度的Real-Time PCR扩增反应。

本制品适用于快速Real-Time PCR扩增反应，可以在宽广的定量区域内得到良好的标准曲线，对靶基因进行准确定量、检测，重复性好，可信度高。

本制品预先混有Taq DNA Polymerase、PCR Buffer、dNTPs、SYBR Green I荧光染料、稳定剂和镁离子等通用组分，只需加入模板、引物、双蒸水便可进行Real-Time PCR反应，操作简单方便。

• 使用前，请上下轻轻颠倒混匀，避免产生气泡，防止因混合不均匀造成的反应效果不佳。
  
  • 请勿涡旋振荡混匀。
    
  • 2×SYBR Green qPCR预混液在-80℃存放可能会产生白色或淡黄色沉淀，用手握缓慢溶解，于室温短时间避光放置，轻柔上下颠倒混匀直至沉淀全部消失。
    
  • 沉淀会导致溶液成分不均匀，使用前务必充分混匀试剂。
• 配制反应液时，试剂请于冰上放置。
  
• 本制品中含有荧光染料SYBR Green I，配制PCR反应液时避免强光照射。
  
• 反应液的配制、分装请一定使用新(无污染)枪头、Microtube等，避免污染。
  
• 本制品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品。
  
• 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

• 配置反应体系
  建议的模板量10～100ng (基因组DNA)或1～10ng (cDNA模板)。
  按下表加入各成分配制PCR反应液(反应液配制请在冰上进行)
  

  成分	10μL体系	20μL体系	50μL体系	终浓度
  2×SYBR Green qPCR预混液	5μL	10μL	25μL	1×
  PCR Forward Primer(10μM)	0.2μL	0.4μL	1μL	0.2μM
  PCR Reverse Primer(10μM)	0.2μL	0.4μL	1μL	0.2μM
  Reference Dye(可选)	0.2μL	0.4μL	1μL	1×
  DNA模板	1μL	2μL	4μL	-
  ddH2O	3.4μL	6.8μL	18μL	-
  总体积	10μL	20μL	50μL	-

  • 通常引物终浓度为0.2μM可以得到较好的结果。反应性能较差时，可在0.1～1.0μM范围内调整引物浓度。
    
  • 在20μL反应体系中，DNA模板的添加量通常在100ng以下。因不同种类的DNA模板中含有的靶基因的拷贝数不同，必要时可进行梯度稀释，确定合适的DNA模板添加量。
    
  • 按照各仪器推荐体系进行反应液配制。
• 进行Real-Time PCR反应
  建议采用下列图表显示的两步法PCR反应程序，如果该程序得不到良好的实验结果时，再进行PCR条件的优化。由于使用Tm值较低的引物等原因，两步法PCR反应扩增性能较差时，可以尝试进行三步法PCR扩增反应。
  

  两步法					三步法
  步骤		温度	时间	循环数	步骤		温度	时间	循环数
  热启动		95℃	5～10min	1	热启动		95℃	5～10min	1
  PCR 反应	变性	95℃	15sec	40	PCR 反应	变性	95℃	15sec	40
  	退火/延伸	60℃	30～60sec			退火	50～60℃	30sec
  熔解曲线分析		95℃	15sec	1		延伸	72℃	30sec
  		60℃	60sec		熔解曲线分析		95℃	15sec	1
  		95℃	15sec				60℃	60sec
  							95℃	15sec

  • 95℃加热5min激活热启动DNA聚合酶；
  • 如果扩增序列富含GC，激活时间需延长至10min。